O diagnóstico de defeitos na subunidade causados por mutações no gene HEXA requer a demonstração específica da deficiência de actividade da enzima Hex A na presença de uma actividade normal ou mesmo elevada da Hex B. 

Isso pode ser realizado através da separação das enzimas Hex A e Hex B pelo uso de substratos artificiais cromogénicos ou flurogénicos que são hidrolizados por ambas as enzimas. Alternativamente, pode-se utilizar um substrato especificamente hidrolizado pela Hex A. 

Essas enzimas são usualmente separadas por cromatografia ou por eletroforese. Enquanto a eletroforese permite somente um ensaio qualitativo, as outras técnicas permitem uma determinação quantitativa de cada enzima. 

Os programas de rastreio utilizam métodos enzimáticos baseados na baixa estabilidade térmica e no pH da Hex A. No pH 4,4 a Hex B é estável até 55° C, entretanto a Hex A é inactivada com uma meia-vida de 10 minutos, na temperatura de 50° C, e de 3 minutos em 55°C. A actividade total é mensurada antes e depois da desnaturação selectiva da Hex A e a actividade das enzimas é calculada pela diferença entre essas medidas.
O substrato sintético 4MUGS é hidrolizado quase exclusivamente pela Hex A esse substrato provou ser útil no diagnóstico da DTS, particularmente na variante B1. 

Infelizmente, os ensaios com esse substrato não fazem a distinção dos heterozigóticos para os alelos responsáveis pela pseudodeficiência, nem são tão sensíveis como os substratos. 

O método mais específico para a determinação da actividade da enzima Hex A emprega o substrato natural, gangliosídeo GM2, na presença da proteína activadora. Esse substrato é útil para o diagnóstico pré-natal da variante B1 ou para diferenciação entre as variantes infantil e crônica.
Como a eletroforese é um ensaio qualitativo, fazemos gerlamente em 2ª lugar a cromatografia, pois o que interessa é a quantidade da enzima em questão.